1．前言

单克隆游离轻链（FLC）（常称为本-周蛋白）是由B-细胞恶性克隆产生的均一的k或l免疫球蛋白轻链分子。它们是诊断与监测轻链型多发性骨髓瘤（LCMM）和轻链淀粉样变性（AL）重要的肿瘤标志物。用蛋白电泳（PE）或免疫固定电泳（IFE），常在尿中检测到FLC。然而，这些技术耗时、相对的不敏感、可能不精确。而且，尿FLC含量受肾小管功能的影响较大，所以尿中FLC的浓度精确的反应病人疾病的状态。

替代尿的检测的是测定血清FLC浓度。在最近的一系列研究发现，用高敏的免疫测定法，对于非分泌型骨髓瘤（NSM）和LCMM的诊断，血清FLC的检测优于传统的尿电泳检测。由于本实验数倍敏感与电泳检测，所以用本方法检测血清样本，对70%的NSM、>95%AL病人和所有的LCMM作出诊断。这种在疾病诊断率方面的巨大进步可以替代尿的检测。由于结果的敏感性和精确性，在监测疾病的过程中同样具有优势性。

2． FLC的合成与代谢

在B-细胞和浆细胞的正常的免疫球蛋白合成过程中，有大量的、过剩的FLC分子的产生，进入血液和血管外间隙。肾对处理FLC具有重要作用，它通过肾小球滤过而从血液中快速清除。然后被近端肾小管细胞吸收和分解代谢。FLC与刷状缘膜上低亲合性、高能的受体结合。这个复合物进入细胞内被溶酶体分解。研究表明大量的单克隆的FLC（10-30g/天）可以被肾脏吸收，所以只有非常少的FLC逃过近端肾小管的重吸收。在远端小管黏膜表面，特别是尿道黏膜可以分泌一些FLC，所以在正常的尿中含有少量的FLC和分泌型的IgA和其它免疫球蛋白。

在LCMM中，肾损害发生于过剩的FLC超过了近端肾小管的吸收能力时，导致FLC进入到Henle上升环，沉淀为管型，常与Tamm-Horsfall蛋白有关，或进入尿液。随后的个别肾单位的衰竭增加了FLC对剩余的肾单位的负荷，导致渐进性肾损伤。

通常情况下，在每个人的肾脏中有1.3´10⁶肾单位。肾小球孔的大小是可变的，可容许通过30kDa -60kDa大小的分子。这正适合以分别以单体的κ和二聚体的λ分子的清除。κ单聚体（25kDa）的分子量小,其滤过率是二聚体的λ近三倍，因此尽管产生的κ更多，但正常血清中λ含有更高。

图2阐述了在LCMM增生期间患者FLC在血和尿中的浓度变化。随着瘤负荷的增加，并产生更多的FLC，血清FLC浓度增加超过正常范围。相反，尿分泌的FLC仅小幅度的增加直到超过了近端肾小管的重吸收能力。至此FLC溢出进入尿液，LCMM患者才可通过尿标本检测出来。因为FLC可通过自由肾脏滤过，如患者无肾损害，与检测尿液相比，血清浓度则更能精确的反映瘤细胞所产生的FLC的量。正如糖尿病患者的血糖检测一样，在诊断和治疗方面血清中的糖浓度较尿糖浓度更可信，从而取代了传统的尿糖测定。

随着FLC产生的增加，血中浓度逐渐升高，尿中浓度也进行性升高。最终肾功能损害进行性加重，肾小球的滤过越来越少，血清FLC迅速增加。主要是肿瘤产生的FLC和不能被剩余的肾小球滤过FLC。在肾功能衰竭的终末期，血清FLC浓度可能特别高，而尿中浓度非常低。

3.游离轻链测定

血清蛋白电泳（PE）是单克隆免疫球蛋白病常用的检测手段，其灵敏度介于0.5-6g/l。这一范围相当宽，这是因为单克隆免疫球蛋白在γ球蛋白区域能够被识别出来，而在β球蛋白区域则不能够被识别。他们能够覆盖血清转铁蛋白或补体C3从而使得检测变得困难。在实际操作过程中实验室质控发现血清样本通常包含不能被检测到得更高浓度单克隆蛋白。采用血清蛋白电泳（PE）47%的实验室无法检测出5.3G/L的IgAλ单克隆蛋白。高浓度单克隆FLC无法被检测出，不仅是因为蛋白向阳极迁移更应为他们沉淀分散。

血清免疫固定电泳（IFE）较血清PE灵敏度高得多，其检测范围为100-300MG/L的单克隆免疫球蛋白。因此在检测LCMM是应包括了血清的IFE以及血清PE。但IFE有如下的缺点：无法定量，已造成视觉误差，需要费神。因此其应用无法得以广泛开展。毛细血管区域电泳（CZE）及血清总κ和λ分析也被用于检测游离轻链，但结果欠可靠。16名LCMM患者血清样本采用IFE为阳性，而采用CZE则为阴性。仅五名患者的总轻链异常，但所有患者采用血清FLC免疫测定则均为异常。

FLC通常采用尿标本进行检测。尿PE和IFE为灵敏度高，可检测到低达10mg/l的FLC。但是由于蛋白尿的存在，一般并不能够达到理想的灵敏度。这见于许多骨髓瘤患者，可在凝胶上产生很重背景的污染，因此低浓度的FLC代很难以被检测到。此外，多克隆FLC可形成梯形带沉淀，从而掩盖了真正的单克隆FLC带。

总体而言，在检测其他肿瘤标志物时，电泳方法较免疫测定相比，其灵敏度低且更为复杂。例如，癌胚抗原的灵敏度通常需达μg/L，自动分析仪在几分钟内即可产生结果，与检测浓缩尿中的FLC相比，采用自动分析仪可检测到所有临床需要及正常范围的FLC浓度，这一方法显然更为可取。然而，此种方法的发展受到如下两个主要因素的限制：（1）难以产生仅与血清中游离轻链相结合而不与结合于免疫球蛋白的轻链相中和的特异性抗体，（2）且能够与所有单克隆轻链反应的抗体。

在分析仪之前，早期血清免疫测定采用的是柱层析的方法将FLC免疫球蛋白中分离出来，但此种方法不能够为临床常规使用。随后的方法采用针对位于免疫球蛋白轻重链界面之间的潜在抗原表位的抗体进行测定。由于早期的放射免疫测定（RIA）和酶联免疫测定(EIA)均采用非特异性多克隆抗体，故他们仅能够采用尿标本进行检测。随后产生了单克隆抗体，但其特异性和亲和力仍然无法解决。而且，由于它们的应用仅限于RIA以及EIA，对于临床免疫化学实验室，这些是一种相当棘手的技术。采用多克隆抗体进行过较为简便的比浊法以及乳胶加强的比浊测定也为能够很灵敏的探测到正常血和尿中的FLC，且交叉反映很多。

抗体制造技术的发展以及对血清FLC重要临床意义认识的深入，激励我们不断研究改进这一测定方法。下面是对这一探索过程的总结概括。

游离κ和λ轻链蛋白经纯化后接种于绵羊，随后免疫球蛋白的抗血清被吸附，只剩下特异性针对FLC抗体。将各个抗体分别与各FLC的单聚体和二聚体采用免疫沉淀技术进行反应，它们与免疫球蛋白或可替代轻链的交叉反应<1:5000。抗体的F(ab) ₂片断连接于乳胶颗粒并在Beckman IMMAGE^TM 蛋白分析仪和Dade Behring BN^TMⅡ上测定血清FLC。

游离κ和λ的灵敏度经1：10稀释后分别为3.6mg/L，和5.6mg/L。 这一测定方法用于测定FLC时比血清蛋白电泳灵敏度提高了500倍，比血清免疫固定电泳的灵敏度提高了超过50倍。组内和组间精确度的变异系数分别为近4%和6%。测定的特异性通过与已知浓度的免疫球蛋白、胆红素、甘油三酯、血红蛋白、以及类风湿因子测定进行评估。ΚFLC测定与完整的κ免疫球蛋白有轻度交叉反应，两种轻链均与类风湿因子有轻微交叉反应而与其他物质的反应则很小。由于有乳胶颗粒稳定抗原/抗体复合物，抗原过量是测定可适当粗略。因此，每一测定均与据10种不同本周蛋白所得校准曲线相平行一致，且抗原测定范围之间并无显著差异。但我们须认识到由于存在结构及抗原表位的差异，并非所有抗体能与所有单克隆FLC产生一致的反应。

4标准化

由于缺乏国际参考的标准对照，研究者们进行了大量努力来标准化这一测定方法。首先这需要纯化FLC。多克隆κ和λ单聚体分子经对多克隆IgG还原作用和烷基化作用产生，多克隆IgG已经200供者的正常血清池中产生。烷基化FLC经蛋白L、抗体亲和色谱法、凝胶过滤色谱法联合纯化，通过银染SDS-PAGE、斑点印迹、和血细胞凝集抑制反应显示其纯度可超过99%。随后采用测定BCA^TM方法精确测定蛋白的浓度。第二对照材料来源于9型κ和7型λ本周蛋白，但这一资料由于它们的单克隆特性并不能够作为常规使用。第三对照材料来源于多克隆FLC升高的SLE患者血清。采用单向免疫扩散法（RID）依照第二对照确定纯化FLC提取物的κ和λ值，随后再用确定值采用比浊法来确定SLE 患者的血清FLC值。每一期值的转化均稀释三倍并重复三次。SLE多克隆FLC血清最终用于来确立供者和不同临床背景的患者的血清FLC浓度。

5正常范围

一些研究已经确定了血和尿中FLC的正常范围（表2）。在我们100列样本的研究中，血清游离κ的平均浓度为8.4mg/L（S.D.±2.66;范围3.6-15.9mg/l;95%参考范围4.2-13.1mg/l）,游离λ的平均浓度为14.5mg/l(S.D.±4.4MG/L;范围8.1-33MG/L;95%参考值范围9.2-22.7mg/l)。血清平均κ/λ比值为0.6（95%参考范围0.36-1.01）。具体结果见图3。FLC浓度随着年龄增长略有增高，尤其是年龄超过70岁个体因肾功能进行性减退因而升高更为明显，但κ/λ比值保持不变。当确定正常值时，应考虑到FLC年龄依从性这一因素。总体而言，这些研究结果与先前公布的正常参考值范围大体上具有可比性。应认识到正常值范围的测定尤其关于FLC比值，尿结果（表2）比血清样本更具有可比性。其差异可能部分是由于血清中存在的免疫球蛋白而尿中无此蛋白与抗血清产生的交叉反应所一致。抑或是由于单克隆抗体检测FLC分子的能力不尽相同。这也已成为我们的经验，并是为何我们选择多克隆抗体的原因。

我们的研究发现在正常血清中游离κ链浓度较λ链低，这一结果或许令人震惊，因为我们知道正常产生κ链的淋巴细胞数量几乎是产λ链细胞的两倍。可能的原因是κ链形成单聚体（25kDa）与λ链形成二聚体(50kDa)的分子大小不同造成了肾脏对它们的清除率不同。一项研究右旋糖苷聚合体通过毛细血管基底膜运动的研究表明：20kDa大小的分子清除率是32kDa分子的3.2倍。我们的研究结果显示κ/λ清除率的比值是3。多聚糖于通过肾小球的蛋白分子大小相同但结构不同，但不同的κ/λ滤过比可解释血清κ链浓度比λ链浓度低。由于早期抗血清的特异性差，在早期的FLC研究中或许并不能够观察到这一现象。采用单克隆抗体测定正常血和尿标本时也可能产生不同的结果。这些差异是否由于特异性或标准化或者是基质问题所引起仍不清楚。

6 FLC和电泳测定的灵敏度比较

研究者已经比较了PE,IFE,和比浊法测定FLC的灵敏度。采用PE能够检测到血清FLC的浓度范围在500-2000mg/l，这取决于单克隆FLC能否分别迁移到γ或β区。IFE的检测低限为150mg/l。而免疫测定可检测到3-4mg/l的FLC。灵敏度的改进可在临床全程检测到FLC浓度的变化无论其浓度高或低或正常。这一点尤为重要，因为当存在骨髓抑制时，κ/λ比值可反映出轻链扩增的程度。无可争辩的是，与先前的免疫测定相比，测定可替代轻链的灵敏度的提高可更是用于临床工作。

电泳测定在理想实验室条件下可检出单克隆蛋白。但在临床实际操作过程中，常常难以达到此种条件。尤其当FLC形成聚合物时，它们在电泳中迁移形成宽的弥散带。再LCMM患者中常可看到此种情形，即便血清中FLC的浓度达到了10g/l时，采用血清PE以可能并未检出异常。甚至与高分辨电泳相比，FLC免疫测定的灵敏度比血清PE的高出50多倍，为血清IFE的多30倍。尿中FLC检测限度受到样本浓缩程度的影响，可能达到电泳的100倍。由于尿中本底蛋白的浓度较低，其灵敏度显然比血中的要高，但蛋白尿和梯形带则会降低灵敏度。FLC在纯尿中的灵敏度要高得多，其最低可检测达1mg/l

7临床标本的FLC测定与IFE的灵敏度比较

经临床标本比较了血清FLC改进的免疫测定和IFE的灵敏度。在IFE的检测限度或无法检测出的46例血清FLC标本，采用了免疫测定的方法。结果显示，45例样本在免疫测定时为异常，而IFE仅检出了37例。这些结果提示我们，在评估经PE检测阴性而临床怀疑有单克隆FLC产生的血标本时，至今，尚未有关于IFE和FLC测定单克隆游离轻链的前瞻性比较研究。

8 FLC测定的临床应用

血清FLC测定对于B细胞和浆细胞疾病具有巨大临床应用价值。已有的研究资料是关于LCMM、NSM、部分MM以及Waldenstrom’s巨球蛋白血症。也有关于AL和轻链沉积病（LCDD）的报道。其他疾病如冒烟性骨髓瘤、浆细胞瘤、MGUS、B细胞白血病、淋巴瘤等正在研究之中。图3以图形式描述了这些研究中的部分研究结果。途中所有的κ、λ、κ/λ比值可在同一图中显示，故而这是解释临床结果的有效方式。

9 轻链型骨髓瘤

LCMM占所有MM的15%。由于接近低水平的FLC无法为血清的PE所检出，因此用于疾病诊断和监测的常用实验室手段是对尿标本浓缩100倍后进行PE或IFE。

在近期的一项研究中，进入UK MRC骨髓瘤试验的224名LCMM患者的血清FLC结果进行了测定。所有120κ和104名λ型患者除尿中FLC浓度升高外，血中FLC浓度也很高。但是在经放射免疫扩散时，血和尿的浓度的并无相关性。在一项独立试验中，所有28名LCMM患者具有相似的检测结果。因此，我们认为血清FLC测定可取代24小时尿FLC测定。

LCMM患者经化疗后，其血和尿的FLC浓度平行下降。图5显示了两名患者血和尿FLC系统监测的结果。在图5a中，尿中FLC浓度无法检出时，仍可发现血中浓度持续上升。故血清监测患者疾病进展时似乎更为灵敏。

图5b显示了经化疗的一名患者血清FLC浓度变化特征。

1采用IFE几乎检测不到血和尿FLC浓度，因此无法获得电泳的定量资料。相反，经免疫测定发现其血清FLC浓度很高，故可明确用于疾病监测。

2在复发期间，骨髓活检仅显示出其浆细胞比例为5%，而X-线和MRI扫描结果正常，然而FLC浓度升高是肿瘤复发的可靠证据，并由此开始了新的化疗。

3在复法期间κ/λ比值的升高表明了肿瘤复制的时间约为34天，这提供了预后信息。

4非瘤轻链的浓度变化反映了正常浆细胞对化疗的反应和/或肾功能的变化。这一信息有助于评估化疗对骨髓功能的毒性反应和/或肾功能的变化。

血清FLC的测定或许还有其他用途：

1对一些产生免疫球蛋白和FLC单克隆蛋白的患者，FLC的半衰期短（2-4小时），较IgG（半衰期21-25天）更适用于肿瘤化疗的监测。这或许也可能对评估个体对化疗各疗程的疗效反应。

2LCMM患者的血清FLC的浓度可由正常时的20-30mg/l升高到100000mg/l。这一巨大测定范围玉、单克隆免疫球蛋白的较小变化范围相比，更适用于评估肿瘤负荷的变化。

10非分泌型骨髓瘤

NSM据定义是指采用常规电泳技术在血和尿中均无法检测到单克隆蛋白，占所有MM患者的1%-4%。对28名此类患者的血清FLC测定发现有20名患者的浓度高于正常，许多患者的κ/λ比值显著异常。对四例血清的进一步检测发现，一例FLC受抑，两例κ/λ比值异常。采用IFE对28例患者进行仔细的重复试验发现有6例患者血清中检出单克隆FLC，但单克隆带很弱且弥散。奇怪的是，其中9名患者即使在免疫测定时FLC浓度超过200mg/l,这一浓度已经足够为IFE所检出，但经IFE检测并未发现其单克隆带，随机抽取的两例患者FLC浓度很高（分别为980MG/L,和1700MG/L），其中包含了FLC的多聚合物（40-200kDa）。IFE检测的许多NSM患者样本出现弥散带或无可见免疫沉淀区，这一现象或许是由于FLC形成了多种聚合物所致。与FLC单聚体相比，如此大分子量的多聚物经肾的清除率定要小得多，这可部分解释了许多NSM患者尿FLC检测阴性，而患者肾功能仍然相对完好。在κ型NSM患者中经IFE检出弥散带的现象较λ型NSM更常见，这表明聚合物更多见于κ型NSM。这也符合了文献报道的NSMκ/λ两型比例为 4：1的现象。

临床对28例中的6例患者进行了血清FLC测定随访，发现在测定当时浓度的升高，在平台期浓度下降，而在复发期间浓度复又上升。这表明血清FLC测定可用于许多NSM患者的临床管理，并可减少因需要对患者当时肿瘤负荷评估而进行的骨髓活检的次数。

11多发性骨髓瘤，冒烟性骨髓瘤，华氏巨球蛋白血症以及意义未明的单克隆免疫球蛋白血症(MGUS)

已有一些资料报道了这些疾病的FLC浓度，并且还报道了大多数产生完整免疫球蛋白的MM患者血清中具有同种类型过剩的单克隆轻链蛋白。FLC半衰期短极其巨大临床范围提示他比免疫球蛋白更适用于疾病的监测。有研究已经表明，尿FLC水平的下降是化疗反应有效的征兆，但血清FLC定量或许更为精确。血清FLC浓度也能够为MM诊断和分期提供更为精炼的标准。

MGUS尿单克隆FLC提示肿瘤的发生，但患者疾病状态可稳定多年。或许血清FLC测定能够反映疾病的变化，并为MGUS向MM进展提供指引。

12 原发性淀粉样变性患者的诊断和监测

近10-15%的AL患者采用常规PE和IFE检测血和尿的标本并不能发现单克隆免疫球蛋白带，50%-70%的患者血清中可检出单克隆免疫球蛋白，但极少能够对淀粉样变性的轻链进行定量（表3）。比较而言，183名确定患有原发性系统性淀粉样变的患者中，有180名患者定量检出其淀粉样变性的FLC过量，选择性对18名AL患者样本碱性检测发现65%的样本血清FLC浓度异常，而先前经血和尿的电泳检测这些标本浓度均正常。

对24名AL患者的FLC浓度进行了连续监测，这当中有22名患者已接受了化疗，6名患者化疗前接受了实体器官移植。2/3的患者的血和/或尿标本以前可经PE或IFE定量检出低浓度单克隆免疫球蛋白或FLC。11名经化疗后淀粉样变性减退的患者血清FLC连续免疫测定显示淀粉样变源性轻链浓度下降达47%-99.5%。7名患者淀粉样物质沉积疾病进展，其中四名随着化疗其FLC浓度仍升高，和疾病难治相一致。其他3名FLC下降达25%-36%的患者似乎并不能够阻止淀粉样物质沉积的进展。6名患者FLC浓度无有意义的变化。

对LCDD患者分别经免疫测定和血和尿的IFE测定的研究发现，15名κ型患者检出12名和8名患者的FLC浓度升高，而3名λ型患者经两种方法均发现有升高。这在一次表明了免疫测定比电泳检测灵敏。

因此，血清FLC测定对于识别和监测AL以及LCDD患者极其有益，尤其当FLC浓度变化时着可提供缓则病情变化的信息。FLC连续定量测定能够评估个体对化疗的反应，并可对个体化疗方案进行精细调节。

13 FLC测定在其他临床疾病中的应用

由于FLC每日均是通过肾脏清除，故任何肾小球过功能的减退均会出现血中κ和λ链浓度的升高，但是κ/λ比值则保持在一个相对较小的范围内变化。这可见于对不同程度肾功能损害的30名患者的样本的检测（图3），他们的肾功能损害均非FLC沉积所致。可观察到有单克隆FLC疾病的患者的肾功能随着可替代轻链的变化而变化。许多LCMM患者的可替代轻链浓度可明显升高。

κ和λ浓度的升高也与多克隆B细胞活化所致的多克隆高丙球蛋白血症相关。这些也可见于自身免疫性疾病的患者，如SLE和结节病、结核等慢性炎症性疾病。FLC的升高同样也见于多发性硬化症患者的尿和脑脊液中。由于血清FLC免疫测定比电泳测定敏感性更高，故而极有可能在其他疾病中发现多克隆FLC浓度升高。

14 FLC测定的局限性

FLC免疫测定通过检测κ/λ比值评估浆细胞的克隆性。这和电泳检测到的肉眼可见的迁移区带明显不同。由于前种方法采用的是数据评估而后者采用的是肉眼半定量检测，因此前者方法毫无疑义更可取。由于NSM患者电泳检测不到肉眼可见的单克隆沉淀区带，其k/l比值异常，故在一些情况下，κ/λ比值极其重要。然而浆细胞的克隆增生是客观可见的，因此有可能与新的说明步骤产生矛盾。FLC定量测定的另一个问题是准确度。由于每个单克隆蛋白具有结构特异性，检测结果将取决于抗体识别个体分子形态变化和聚合物结构差异的能力。这和比浊法定量单克隆免疫球蛋白相矛盾，但不能因此否认其在临床的广泛用途。

另一个易造成单克隆FLC测定的差错来源于多克隆FLC的存在。当存在多克隆FLC时，将会造成对单克隆FLC量的过高估计。这一过程在有肾功能损害的LCMM患者尤为明显，并且能够观察到可替代FLC浓度的升高。

在这些和其他的情况下，浆细胞的克隆增生需要通过电泳来确定。尽管如此，从临床研究我们可以明确的得到如下结论，FLC免疫测定的理论特异性和准确度的缺乏克通过提高检测的灵敏度来弥补。

15 小结

总之，先前的血清FLC免疫测定或是由于检测技术过于复杂，或是由于抗体缺法特异性，因此临床应用范围很小。最近自动免疫测定能简便的评估FLC浓度。临床研究已经表明，许多MM和AL患者，血清FLC测定对临床诊断和疾病管理有极大益处。骨髓瘤患者FLC测定目前已用于多种其他临床情况如微小残留病、早期化疗反应以及MGUS患者病情的评估。